View in EDS

Оптимизация технологии получения рекомбинантного аннексина V, меченного FITC, для количественной детекции апоптоза в клетках эукариот

Saved in:
Bibliographic Details
Title: Оптимизация технологии получения рекомбинантного аннексина V, меченного FITC, для количественной детекции апоптоза в клетках эукариот
Source: VII Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», шко- ла-конференция для молодых ученых, аспирантов и студентов «Генетические технологии в микробио- логии и микробное разнообразие».
Publisher Information: Crossref, 2024.
Publication Year: 2024
Subject Terms: апоптоз, аннексин V, эукариоты
Description: Аннексин V – Ca2+-зависимый фосфолипид-связывающий белок, обладающий высоким сродством к фосфатидилсерину, широко представленному в поверхностном слое мембраны апоптотических клеток. Конъюгация аннексина V c флюорохромами делает данное вещество оптимальным маркером для количественной детекции программируемой клеточной гибели путем апоптоза в клетках эукариот.Целью нашей работы стала оптимизация технологии получения аннексина V, меченного FITC.Ген аннексина V человека, hANXA5, был синтезирован искусственно и клонирован в экспрессионный вектор pET-28a под контроль промотора фага Т7. Структура гена была оптимизирована для экспрессии в клетках кишечной палочки. По результатам работы был создан штамм-продуцент Escherichia coli BL21(DE3)/pANXA5-28a, в котором в условиях индукции наблюдалась высокоэффективная продукция целевого белка. Анализ экспрессии показал, что исследуемый белок находится преимущественно в растворимой форме. Были подобраны условия, позволяющие получать препарат аннексина V чистотой более 95% с использованием метал-хелатной смолы. Полученный препарат белка был конъюгирован с FITC, и меченый белок был очищен на анионообменном сорбенте.Эффективность использования полученного препарата FITC-меченого аннексина V для детекции клеточной гибели в культуре клеток эукариот была оценена на клеточных линиях рака простаты (PC3, LNCap), рака молочной железы (MCF 7, MDAMB 231), клетках селезенки свиньи (SSS) и клеточной линии первичных моноцитов, выделенных из периферической крови свиньи. Индукция программируемой клеточной гибели путем апоптоза была проведена посредством обработки клеток стауроспорином, который является ингибитором ряда клеточных киназ. В качестве отрицательного контроля использовались образцы клеток, обработанные эквимолярным раствором DMSO. Анализ проб клеточной суспензии, инкубированных с реагентом аннексин V – FITC в диапазоне концентраций 0,4–20 мкг/мл, был проведен посредством проточной цитометрии. Оптимальная концентрация FITC-меченого аннексина V составила 2 мкг/мл.В результате была разработана высокопроизводительная методика получения реагента аннексин V – FITC с выходом 280 мг белка с одного литра бактериальной культуры. Стоимость доступных коммерческих наборов неоправданно высока, что зачастую является лимитирующим фактором для проведения анализа клеточной гибели. Разработанная в данной работе методика получения аннексина V может позволить повысить доступность для проведения исследований в науке и медицине.
Document Type: Article
Conference object
Language: Russian
DOI: 10.34756/geos.2021.17.37976
Accession Number: edsair.doi...........f6b39aff5d80db9e1947e22d6f5daa03
Database: OpenAIRE
Description
Abstract:Аннексин V – Ca2+-зависимый фосфолипид-связывающий белок, обладающий высоким сродством к фосфатидилсерину, широко представленному в поверхностном слое мембраны апоптотических клеток. Конъюгация аннексина V c флюорохромами делает данное вещество оптимальным маркером для количественной детекции программируемой клеточной гибели путем апоптоза в клетках эукариот.Целью нашей работы стала оптимизация технологии получения аннексина V, меченного FITC.Ген аннексина V человека, hANXA5, был синтезирован искусственно и клонирован в экспрессионный вектор pET-28a под контроль промотора фага Т7. Структура гена была оптимизирована для экспрессии в клетках кишечной палочки. По результатам работы был создан штамм-продуцент Escherichia coli BL21(DE3)/pANXA5-28a, в котором в условиях индукции наблюдалась высокоэффективная продукция целевого белка. Анализ экспрессии показал, что исследуемый белок находится преимущественно в растворимой форме. Были подобраны условия, позволяющие получать препарат аннексина V чистотой более 95% с использованием метал-хелатной смолы. Полученный препарат белка был конъюгирован с FITC, и меченый белок был очищен на анионообменном сорбенте.Эффективность использования полученного препарата FITC-меченого аннексина V для детекции клеточной гибели в культуре клеток эукариот была оценена на клеточных линиях рака простаты (PC3, LNCap), рака молочной железы (MCF 7, MDAMB 231), клетках селезенки свиньи (SSS) и клеточной линии первичных моноцитов, выделенных из периферической крови свиньи. Индукция программируемой клеточной гибели путем апоптоза была проведена посредством обработки клеток стауроспорином, который является ингибитором ряда клеточных киназ. В качестве отрицательного контроля использовались образцы клеток, обработанные эквимолярным раствором DMSO. Анализ проб клеточной суспензии, инкубированных с реагентом аннексин V – FITC в диапазоне концентраций 0,4–20 мкг/мл, был проведен посредством проточной цитометрии. Оптимальная концентрация FITC-меченого аннексина V составила 2 мкг/мл.В результате была разработана высокопроизводительная методика получения реагента аннексин V – FITC с выходом 280 мг белка с одного литра бактериальной культуры. Стоимость доступных коммерческих наборов неоправданно высока, что зачастую является лимитирующим фактором для проведения анализа клеточной гибели. Разработанная в данной работе методика получения аннексина V может позволить повысить доступность для проведения исследований в науке и медицине.
DOI:10.34756/geos.2021.17.37976