In EDS ansehen

Использование ИК-спектрометрии для изучения видовой принадлежности и разделения генетических линий на примере рода Eisenia Malm, 1877

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
Titel: Использование ИК-спектрометрии для изучения видовой принадлежности и разделения генетических линий на примере рода Eisenia Malm, 1877
Verlagsinformationen: Zenodo, 2023.
Publikationsjahr: 2023
Schlagwörter: ИК-Фурье спектроскопия, таксономическая идентификация, дождевые черви
Beschreibung: Дождевые черви, являясь инженерами экосистем (Lavelle et al., 1997; Blouin et al., 2013), играют важную роль в почвенной среде и функционировании экосистем за счет перемешивания почвы, переработки опада и создания биогенных структур с особыми свойствами (Bottinelli et al., 2015; Van Groenigen et al., 2019). Их влияние на почву видоспецифично даже в пределах одной экологической группы (Capowiez et al., 2015; Vos et al., 2019), поэтому идентификация видов дождевых червей необходима для правильного понимания их воздействия на функции почвы. Наиболее распространенный способ идентификации – анатомо-морфологическое определение дождевых червей, которое требует определенной квалификации и при этом имеет ряд ограничений. Например, определение неполовозрелых и поврежденных особей часто невозможно, из-за чего они не учитываются в исследованиях (Richard et al., 2010). Также нельзя произвести разделения видов-двойников (генетических линий) (Marchan et al., 2018). Молекулярные методы позволяют определить виды дождевых червей (Shekhovtsov et al., 2017) и идентифицировать криптические виды (Shekhovtsov et al., 2016). Но на практике используются эти методы не так часто из-за высокой стоимости, недоступности оборудования и реактивов, поэтому ведутся поиски альтернативных методов (Vaupel et al., 2022). Инфракрасная спектроскопия оказалась очень полезным и эффективным инструментом для идентификации почвенных организмов (Bellon-Maurel and McBratney, 2011), к тому же не требующим дорогих расходных материалов (Raupach et al., 2016). Показана эффективность ИК спектрометрии для таксономической идентификации бабочек (Tao et al., 2018), мух дрозофил (Aw, Dowell, Ballard, 2012), прямокрылых (Da Silva, Gutjahr, De Morais, 2018), комаров (Sikulu, 2014), долгоносиков (Johnson, 2022), термитов (Jouquet et al., 2018) и дождевых червей (Pham et al., 2021). Также определена возможность идентификации криптических видов муравьев (Kinzner et al., 2015). Эти работы свидетельствуют о том, что различия спектрального состава у особей могут быть связаны с химическим составом их тел, определяемым их видовой принадлежностью. Поэтому мы считаем возможным использовать ИК-спектрометрию как способ идентификации видов дождевых червей и их генетических линий. На территории Западной Сибири и Урала дождевые черви широко представлены родом Eisenia (Всеволодова-Перель, 1997). Род интересен тем, что включает в себя комплекс видов Eisenia nordenskioldi, содержащий несколько линий видов двойников (Shekhovtsov et al., 2017 Shekhovtsov et al., 2020). Цель исследования – изучение химического состава тел дождевых червей рода Eisenia методом инфракрасной спектрометрии для установления возможности его использования для идентификации видов и генетических линий. Задачи: 1. Оценить различия ИК-спектров тел дождевых червей рода Eisenia; 2. Определить существуют ли общие закономерности деления видов по ИК-спектрам, генотипам и по морфо-анатомическим признакам; 3. Установить возможность разделения генетических линий дождевых червей методом ИК-спектрометрии. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Объектами исследования послужили дождевые черви 9 видов рода Eisenia: Eisenia atlavinyteae Perel & Graphodatsky, 1984, E. fetida (Savigny, 1826), E. nordenskioldi nordenskioldi (Eisen, 1879), E. nordenskioldi pallida Malevic 1956, E. sibirica Perel et Graphodatsky, 1984, E. angusta Perel, 1994, E. nana Perel, 1985, E. tracta Perel, 1985, E. ventripapillata Perel, 1985. Дождевые черви были собраны на 6 участках: в окрестностях с. Чернолучье (Омский район, Омская область, N 55°16'33'', Е 73°02'35''), окрестности с. Екатерининское (Тарский район, Омская область, N 56°53'03'' E 74°35'10''), на территории Парка культуры и отдыха имени 30-летия Победы (г. Омск, 54°57' N, 73°21' Е), в окрестностях д. Хомутовки (городской округ Первоуральск, Свердловская область, N 56°51'37.7'', E 59°46'02.8''), в окрестностях п. Большие поля (Омский район, Омская область, N 55°02'40.8'', E 73°22'51.6''), в окрестностях с. Манжерок (Майминский район, Республика Алтай N 51°47'22.0'', E 85°43'32.9''). Видовую идентификацию собранных червей проводили по определителю Т.С. Всеволодовой-Перель (1997) и материалам статьи Т.С. Перель (1985). Для изучения состава тел дождевых червей мы поместили их в 18 двухлитровых пластиковых контейнеров с перфорированными крышками по два микрокосма на каждый вид. Микрокосмы были заполнены 1.5 л почвы, очищенной от макрофауны с помощью сит с диаметром ячейки 4 мм. Во всех микрокосмах в качестве подстилки использовалась сухая листва Populus tremula (L., 1753) по 9.00±0.05 г. Таким образом, мы нивелировали влияние типа почвы и опада на состав тела червей. Почву в микрокосмах поливали одинаковым количеством дистиллированной воды, чтобы поддерживать влажность на уровне 50%. В каждый микрокосм добавляли по 8 особей дождевых червей. В микрокосмах дождевые черви содержались в течение 90 суток, и каждые 30 дней производилась замена почвы. Затем их промывали дистиллированной водой. Для очистки кишечника содержали червей в течении пяти суток в отдельных контейнерах по 2 особи на фильтровальной бумаге, которую меняли по мере загрязнения. После этого их замораживали на 24 ч, заранее удалив последние сегменты тела, так как они часто содержали остатки почвы. Далее червей высушивали при температуре 60°C в течение 48 часов и потом измельчали в порошок. Всего было подготовлено по 6–12 образцов каждого вида. Порошки исследовали в таблетках, спрессованных в смеси с бромистым калием (соотношение 1:100, диаметр 3.5 мм). В качестве опорного спектра использован спектр чистого бромистого калия, предварительного высушенного при температуре ~600 °С в течение 6 часов. ИК-спектры поглощения регистрировали на ИК-Фурье-спектрометре «ФТ-801» (СИМЕКС) в диапазоне 500–4000 см–1 (число сканов 32, разрешение 4 см–1). В спектрах были удалены полосы, связанные с CO2 интерференцией (1800-2600 см–1). Для анализа данных были выбраны только спектры от 3500 до 500 см–1, чтобы не учитывать шум на двух краях спектрального диапазона. Коррекция базовой линии и нормализация спектров произведена с использованием программного обеспечения ZaIR 3.5 (СИМЭКС). Для статистической обработки и моделирования на всех спектрах определяли положение, интенсивность и площадь полос поглощения (ПП). Различия характеристик ПП видов дождевых червей проверяли с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим использованием попарного критерия Тьюки (Tukey HSD test) в программном пакете Statistica 13.0. Анализ методом главных компонент (PCA) и линейный дискриминантный анализ (LDA) были выполнены в программном пакете R. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Типичный ИК спектр червя рода Eisenia приведен на рис. 1. В целом по функционально-групповому составу исследуемые виды близки. Дисперсионный анализ с последующим тестом Тьюки показал, что основные отличия наблюдаются для ПП 1080, 1154, 1236, 1316, 1454, 1544, 2929, 3079 см–1 при P = 0.05 (рис. 2). Анализ методом главных компонент по площадям пика показал, что разделение видов по спектральному составу тел по большей части согласуется с диагнозом, который был присвоен дождевым червям при морфо-анатомической идентификации. Ряд видов со сходным спектральным составом пересекаются на факторной плоскости, что может говорить об их родовой близости или они могут быть видами-двойниками. На факториальной плоскости хорошо видно, что E. fetida хорошо отделен от остальных изученных представителей рода Eisenia (рис. 3). Отмеченная закономерность соотносится с результатами исследования Чузди с соавторами (2022), согласно которому род Eisenia содержит две клады: европейскую, в которую входит E. fetida, и азиатскую, включающую виды E. nordenskioldi, E. tracta и E. nanа. Вид E. nordenskioldi неоднократно пытались разделить на более мелкие таксоны из-за его морфологического, кариологического и экологического разнообразия (Shekhovtsov et al., 2020). Почвенный E. n. pallida получил статус непигментированного подвида E. nordenskioldi (Всеволодовой-Перель, 1997). В своем исследовании С.В. Шеховцов с соавторами (2020) на основании генетических данных указывает, что непигментированные особи с диагнозом E. n. pallida относятся к нескольким генетическим линиям. По полученным нами данным спектральный состав тела E. n. pallida отличается от почвенно-подстилочной E. nordenskioldi (рис. 3). Согласно генетическому анализу (Shekhovtsov et al., 2017; Shekhovtsov et al., 2020) исследуемые нами E. nana и E. nordenskioldi относятся соответственно к 5 и 6 линии генетического комплекса E. nordenskioldi. По полученным нами спектральным данным E. nana и E. nordenskioldi различаются (рис. 3), как и их морфологическая структура. Голованова Е. В. относит их к двум разным видам (неопубликованные данные). Данный факт также подтверждают исследования Чузди с соавторами (2022), где E. nana рассматривается как отдельный вид. Экологические исследования воздействия E. nana и E. nordenskioldi на почву показало, что данные виды различно изменяют катионный состав (Бабий и др., 2021), а также определен разный ионный состав их копролитов (Babiy et al., 2021). Некоторое сходство химического состава тела E. nana и E. tracta выглядит закономерным, так как согласно данным Чузди с соавторами (2022) это два близкородственных вида, но чтобы сделать подобный вывод по спектральному анализу нужно увеличить размер выборки для E. tracta. Сходство спектрального состава тела E. nordenskioldi и E. atlavinyteae говорит о том (рис. 3), что всё-таки E. atlavinyteae не представляет собой отдельный вид, что совпадает с данными генетического анализа (Shekhovtsov et al., 2020). E. sibirica собрана в месте, где был отобран типовой экземпляр, поэтому не удивительно, что она сильно отличается по химическому составу тела от E. nordenskioldi, у которой встречаются особи с морфологией, подходящей под диагноз E. sibirica. С другой стороны, выборка для E. sibirica была небольшой, поэтому для более точного диагноза необходимо провести дополнительные сборы и исследования. Химический состав тела E. ventripapillata сильно отличается от состава других изученных представителей рода Eisenia, поэтому его статус отдельного вида очевиден и не подвергался сомнению ранее (Перель, 1985). Для проверки возможности использования данных спектров ИК идентифицировать виды дождевых червей использовали линейный дискриминантный анализ (табл.). С этой целью весь набор данных, представленный 96 особями, был разделен по видам на две части, из которых (66% выборки) были отобраны для построения модели, а остальные 34% были использованы для оценки точности предсказания. Общая точность (количество правильных прогнозов/общее количество данных проверки) составила 83%, что указывает на приемлемую точность классификации (табл.). ЗАКЛЮЧЕНИЕ Инфракрасная спектроскопия может использоваться в качестве метода оценки таксономического статуса дождевых червей или служить дополнением к молекулярным методам. В частности, этим методом можно проводить первичную оценку собранного материала дождевых червей и по полученным данным проводить отбор особей для дальнейшего генетического анализа.
Publikationsart: Part of book or chapter of book
Sprache: Russian
DOI: 10.5281/zenodo.10056916
Rights: CC BY
Dokumentencode: edsair.doi...........e8fab9e4df1d3eb6e5eb4a6c9f5098e3
Datenbank: OpenAIRE
Beschreibung
Abstract:Дождевые черви, являясь инженерами экосистем (Lavelle et al., 1997; Blouin et al., 2013), играют важную роль в почвенной среде и функционировании экосистем за счет перемешивания почвы, переработки опада и создания биогенных структур с особыми свойствами (Bottinelli et al., 2015; Van Groenigen et al., 2019). Их влияние на почву видоспецифично даже в пределах одной экологической группы (Capowiez et al., 2015; Vos et al., 2019), поэтому идентификация видов дождевых червей необходима для правильного понимания их воздействия на функции почвы. Наиболее распространенный способ идентификации – анатомо-морфологическое определение дождевых червей, которое требует определенной квалификации и при этом имеет ряд ограничений. Например, определение неполовозрелых и поврежденных особей часто невозможно, из-за чего они не учитываются в исследованиях (Richard et al., 2010). Также нельзя произвести разделения видов-двойников (генетических линий) (Marchan et al., 2018). Молекулярные методы позволяют определить виды дождевых червей (Shekhovtsov et al., 2017) и идентифицировать криптические виды (Shekhovtsov et al., 2016). Но на практике используются эти методы не так часто из-за высокой стоимости, недоступности оборудования и реактивов, поэтому ведутся поиски альтернативных методов (Vaupel et al., 2022). Инфракрасная спектроскопия оказалась очень полезным и эффективным инструментом для идентификации почвенных организмов (Bellon-Maurel and McBratney, 2011), к тому же не требующим дорогих расходных материалов (Raupach et al., 2016). Показана эффективность ИК спектрометрии для таксономической идентификации бабочек (Tao et al., 2018), мух дрозофил (Aw, Dowell, Ballard, 2012), прямокрылых (Da Silva, Gutjahr, De Morais, 2018), комаров (Sikulu, 2014), долгоносиков (Johnson, 2022), термитов (Jouquet et al., 2018) и дождевых червей (Pham et al., 2021). Также определена возможность идентификации криптических видов муравьев (Kinzner et al., 2015). Эти работы свидетельствуют о том, что различия спектрального состава у особей могут быть связаны с химическим составом их тел, определяемым их видовой принадлежностью. Поэтому мы считаем возможным использовать ИК-спектрометрию как способ идентификации видов дождевых червей и их генетических линий. На территории Западной Сибири и Урала дождевые черви широко представлены родом Eisenia (Всеволодова-Перель, 1997). Род интересен тем, что включает в себя комплекс видов Eisenia nordenskioldi, содержащий несколько линий видов двойников (Shekhovtsov et al., 2017 Shekhovtsov et al., 2020). Цель исследования – изучение химического состава тел дождевых червей рода Eisenia методом инфракрасной спектрометрии для установления возможности его использования для идентификации видов и генетических линий. Задачи: 1. Оценить различия ИК-спектров тел дождевых червей рода Eisenia; 2. Определить существуют ли общие закономерности деления видов по ИК-спектрам, генотипам и по морфо-анатомическим признакам; 3. Установить возможность разделения генетических линий дождевых червей методом ИК-спектрометрии. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Объектами исследования послужили дождевые черви 9 видов рода Eisenia: Eisenia atlavinyteae Perel & Graphodatsky, 1984, E. fetida (Savigny, 1826), E. nordenskioldi nordenskioldi (Eisen, 1879), E. nordenskioldi pallida Malevic 1956, E. sibirica Perel et Graphodatsky, 1984, E. angusta Perel, 1994, E. nana Perel, 1985, E. tracta Perel, 1985, E. ventripapillata Perel, 1985. Дождевые черви были собраны на 6 участках: в окрестностях с. Чернолучье (Омский район, Омская область, N 55°16'33'', Е 73°02'35''), окрестности с. Екатерининское (Тарский район, Омская область, N 56°53'03'' E 74°35'10''), на территории Парка культуры и отдыха имени 30-летия Победы (г. Омск, 54°57' N, 73°21' Е), в окрестностях д. Хомутовки (городской округ Первоуральск, Свердловская область, N 56°51'37.7'', E 59°46'02.8''), в окрестностях п. Большие поля (Омский район, Омская область, N 55°02'40.8'', E 73°22'51.6''), в окрестностях с. Манжерок (Майминский район, Республика Алтай N 51°47'22.0'', E 85°43'32.9''). Видовую идентификацию собранных червей проводили по определителю Т.С. Всеволодовой-Перель (1997) и материалам статьи Т.С. Перель (1985). Для изучения состава тел дождевых червей мы поместили их в 18 двухлитровых пластиковых контейнеров с перфорированными крышками по два микрокосма на каждый вид. Микрокосмы были заполнены 1.5 л почвы, очищенной от макрофауны с помощью сит с диаметром ячейки 4 мм. Во всех микрокосмах в качестве подстилки использовалась сухая листва Populus tremula (L., 1753) по 9.00±0.05 г. Таким образом, мы нивелировали влияние типа почвы и опада на состав тела червей. Почву в микрокосмах поливали одинаковым количеством дистиллированной воды, чтобы поддерживать влажность на уровне 50%. В каждый микрокосм добавляли по 8 особей дождевых червей. В микрокосмах дождевые черви содержались в течение 90 суток, и каждые 30 дней производилась замена почвы. Затем их промывали дистиллированной водой. Для очистки кишечника содержали червей в течении пяти суток в отдельных контейнерах по 2 особи на фильтровальной бумаге, которую меняли по мере загрязнения. После этого их замораживали на 24 ч, заранее удалив последние сегменты тела, так как они часто содержали остатки почвы. Далее червей высушивали при температуре 60°C в течение 48 часов и потом измельчали в порошок. Всего было подготовлено по 6–12 образцов каждого вида. Порошки исследовали в таблетках, спрессованных в смеси с бромистым калием (соотношение 1:100, диаметр 3.5 мм). В качестве опорного спектра использован спектр чистого бромистого калия, предварительного высушенного при температуре ~600 °С в течение 6 часов. ИК-спектры поглощения регистрировали на ИК-Фурье-спектрометре «ФТ-801» (СИМЕКС) в диапазоне 500–4000 см–1 (число сканов 32, разрешение 4 см–1). В спектрах были удалены полосы, связанные с CO2 интерференцией (1800-2600 см–1). Для анализа данных были выбраны только спектры от 3500 до 500 см–1, чтобы не учитывать шум на двух краях спектрального диапазона. Коррекция базовой линии и нормализация спектров произведена с использованием программного обеспечения ZaIR 3.5 (СИМЭКС). Для статистической обработки и моделирования на всех спектрах определяли положение, интенсивность и площадь полос поглощения (ПП). Различия характеристик ПП видов дождевых червей проверяли с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим использованием попарного критерия Тьюки (Tukey HSD test) в программном пакете Statistica 13.0. Анализ методом главных компонент (PCA) и линейный дискриминантный анализ (LDA) были выполнены в программном пакете R. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Типичный ИК спектр червя рода Eisenia приведен на рис. 1. В целом по функционально-групповому составу исследуемые виды близки. Дисперсионный анализ с последующим тестом Тьюки показал, что основные отличия наблюдаются для ПП 1080, 1154, 1236, 1316, 1454, 1544, 2929, 3079 см–1 при P = 0.05 (рис. 2). Анализ методом главных компонент по площадям пика показал, что разделение видов по спектральному составу тел по большей части согласуется с диагнозом, который был присвоен дождевым червям при морфо-анатомической идентификации. Ряд видов со сходным спектральным составом пересекаются на факторной плоскости, что может говорить об их родовой близости или они могут быть видами-двойниками. На факториальной плоскости хорошо видно, что E. fetida хорошо отделен от остальных изученных представителей рода Eisenia (рис. 3). Отмеченная закономерность соотносится с результатами исследования Чузди с соавторами (2022), согласно которому род Eisenia содержит две клады: европейскую, в которую входит E. fetida, и азиатскую, включающую виды E. nordenskioldi, E. tracta и E. nanа. Вид E. nordenskioldi неоднократно пытались разделить на более мелкие таксоны из-за его морфологического, кариологического и экологического разнообразия (Shekhovtsov et al., 2020). Почвенный E. n. pallida получил статус непигментированного подвида E. nordenskioldi (Всеволодовой-Перель, 1997). В своем исследовании С.В. Шеховцов с соавторами (2020) на основании генетических данных указывает, что непигментированные особи с диагнозом E. n. pallida относятся к нескольким генетическим линиям. По полученным нами данным спектральный состав тела E. n. pallida отличается от почвенно-подстилочной E. nordenskioldi (рис. 3). Согласно генетическому анализу (Shekhovtsov et al., 2017; Shekhovtsov et al., 2020) исследуемые нами E. nana и E. nordenskioldi относятся соответственно к 5 и 6 линии генетического комплекса E. nordenskioldi. По полученным нами спектральным данным E. nana и E. nordenskioldi различаются (рис. 3), как и их морфологическая структура. Голованова Е. В. относит их к двум разным видам (неопубликованные данные). Данный факт также подтверждают исследования Чузди с соавторами (2022), где E. nana рассматривается как отдельный вид. Экологические исследования воздействия E. nana и E. nordenskioldi на почву показало, что данные виды различно изменяют катионный состав (Бабий и др., 2021), а также определен разный ионный состав их копролитов (Babiy et al., 2021). Некоторое сходство химического состава тела E. nana и E. tracta выглядит закономерным, так как согласно данным Чузди с соавторами (2022) это два близкородственных вида, но чтобы сделать подобный вывод по спектральному анализу нужно увеличить размер выборки для E. tracta. Сходство спектрального состава тела E. nordenskioldi и E. atlavinyteae говорит о том (рис. 3), что всё-таки E. atlavinyteae не представляет собой отдельный вид, что совпадает с данными генетического анализа (Shekhovtsov et al., 2020). E. sibirica собрана в месте, где был отобран типовой экземпляр, поэтому не удивительно, что она сильно отличается по химическому составу тела от E. nordenskioldi, у которой встречаются особи с морфологией, подходящей под диагноз E. sibirica. С другой стороны, выборка для E. sibirica была небольшой, поэтому для более точного диагноза необходимо провести дополнительные сборы и исследования. Химический состав тела E. ventripapillata сильно отличается от состава других изученных представителей рода Eisenia, поэтому его статус отдельного вида очевиден и не подвергался сомнению ранее (Перель, 1985). Для проверки возможности использования данных спектров ИК идентифицировать виды дождевых червей использовали линейный дискриминантный анализ (табл.). С этой целью весь набор данных, представленный 96 особями, был разделен по видам на две части, из которых (66% выборки) были отобраны для построения модели, а остальные 34% были использованы для оценки точности предсказания. Общая точность (количество правильных прогнозов/общее количество данных проверки) составила 83%, что указывает на приемлемую точность классификации (табл.). ЗАКЛЮЧЕНИЕ Инфракрасная спектроскопия может использоваться в качестве метода оценки таксономического статуса дождевых червей или служить дополнением к молекулярным методам. В частности, этим методом можно проводить первичную оценку собранного материала дождевых червей и по полученным данным проводить отбор особей для дальнейшего генетического анализа.
DOI:10.5281/zenodo.10056916