View in EDS

Ферментный препарат на основе клеток Nocardioides simplex для получения ценных 1(2)-дегидрированных 3-кетостероидов

Saved in:
Bibliographic Details
Title: Ферментный препарат на основе клеток Nocardioides simplex для получения ценных 1(2)-дегидрированных 3-кетостероидов
Source: VIII Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов».
Publisher Information: Crossref, 2024.
Publication Year: 2024
Subject Terms: БИОКОНВЕРСИЯ, 1(2)-ДЕГИДРИРОВАНИЕ, ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ, АКТИНОБАКТЕРИИ, 3-КЕТОСТЕРОИДЫ
Description: 1(2)-Дегидрирование является ключевой реакцией тонкого органического синтеза 1(2)-дегидростероидов, высоко востребованных в медицинской практике. В сравнении с насыщенными аналогами, 1(2)-дегидростероиды, как правило, вызывают меньше побочных эффектов при сохранении высокой терапевтической эффективности (Rohman and Dijkstra, 2019). В отличие от микробиологической трансформации, применение энзиматических реакций обеспечивает высокую селективность продукции стероидных продуктов, что позволяет упростить процедуру их очистки (Tonin et al., 2020). Штамм актинобактерий Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033D способен к эффективному 1(2)-дегидрированию 3-кетостероидов андростанового и прегнанового ряда. В его геноме выявлено пять генов, кодирующих 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназы, предположительно, обладающие различной субстратной специфичностью (Shtratnikova et al., 2016). В присутствии индуктора – ацетата кортизона экспрессия одного из генов (kstD2) увеличивается более чем в 1200 раз (Shtratnikova et al., 2021). Известно, что в нативной клетке вероятным акцептором поступающих от 3-КСД окислительно-восстановительных эквивалентов является менахинон дыхательной цепи (Gale et al., 1962). Фермент также может использовать менадион в качестве искусственного акцептора электронов (Gale et al., 1962; Rohman and Dijkstra, 2019). Целью данного исследования являлось создание на основе N. simplex комплексного ферментного препарата, эффективно осуществляющего 1(2)-дегидрирование различных 3-кето-стероидов. Выращивание культуры N. simplex проводили в ферментере (рабочий объем 8 л) аэробно (рО2 30%) при 30 °С на среде с глюкозой (15 г/л), дрожжевым экстрактом (20 г/л), КН2РО4 (4,4 г/л), Na2HPO4 (8,8 г/л), pH 6,9, которую засевали 5% 24-ч инокулятом, выращенным на среде аналогичного состава. Индукцию 1(2)-дегидрогеназной активности осуществляли добавлением к растущей в ферментере 24-ч культуре 21-ацетата кортизона в виде спиртового раствора (конечные концентрации 0,2 и 0,6 г/л для 21-ацетата кортизона и этанола, соответственно). Выросшие индуцированные клетки собирали центрифугированием при 4000 об./мин 30 минут. Готовили суспензию клеток в буфере pH 6,9 и использовали для приготовления ферментного препарата или хранили при –18 °С в течение 6 месяцев до последующего использования. Суспензию клеток обрабатывали при интенсивном перемешивании ацетоном, отделяли центрифугированием, сушили, при растирании сухих клеток получали порошок ферментного препарата. Биоконверсию 3-кетостероидных субстратов проводили в среде с метилированным циклодекстрином и менадионом. Анализ продуктов биоконверсии проводили методом ТСХ в системе растворителей бензол : ацетон = 3:1, стероиды визуализировали в УФ-свете при 254 нм. Оптимизировали следующие параметры: время и режим обработки клеток ацетоном, температуры, pH, концентрации биомассы и менадиона, концентрации субстрата и другие условия биоконверсии. Некоторые характеристики полученного препарата представлены в табл. 1. Неоспоримыми преимуществами применения комплексного ферментного препарата по сравнению с нативными клетками N. simplex является отсутствие нежелательных реакций восстановления по 17β и 20β-позициям стероидной молекулы, а также деструкции стероидного ядра. Преимуществом препарата в сравнении с очищенными 3-КСД является простота, технологичность и дешевизна получения и расширение субстратного спектра. Таким образом, получен ферментный препарат, обладающий 1(2)-дегидрогеназной активностью в отношении различных 3-кето-стероидов, найдены оптимальные условия его эффективного использования. Результаты имеют высокую практическую значимость для разработки новых технологий производства ценных 1-дегидростероидов.
Document Type: Article
Conference object
Language: Russian
DOI: 10.34756/geos.2022.17.38378
Accession Number: edsair.doi...........ce84fde9f9ca938e45e583099beef85c
Database: OpenAIRE
Description
Abstract:1(2)-Дегидрирование является ключевой реакцией тонкого органического синтеза 1(2)-дегидростероидов, высоко востребованных в медицинской практике. В сравнении с насыщенными аналогами, 1(2)-дегидростероиды, как правило, вызывают меньше побочных эффектов при сохранении высокой терапевтической эффективности (Rohman and Dijkstra, 2019). В отличие от микробиологической трансформации, применение энзиматических реакций обеспечивает высокую селективность продукции стероидных продуктов, что позволяет упростить процедуру их очистки (Tonin et al., 2020). Штамм актинобактерий Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033D способен к эффективному 1(2)-дегидрированию 3-кетостероидов андростанового и прегнанового ряда. В его геноме выявлено пять генов, кодирующих 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназы, предположительно, обладающие различной субстратной специфичностью (Shtratnikova et al., 2016). В присутствии индуктора – ацетата кортизона экспрессия одного из генов (kstD2) увеличивается более чем в 1200 раз (Shtratnikova et al., 2021). Известно, что в нативной клетке вероятным акцептором поступающих от 3-КСД окислительно-восстановительных эквивалентов является менахинон дыхательной цепи (Gale et al., 1962). Фермент также может использовать менадион в качестве искусственного акцептора электронов (Gale et al., 1962; Rohman and Dijkstra, 2019). Целью данного исследования являлось создание на основе N. simplex комплексного ферментного препарата, эффективно осуществляющего 1(2)-дегидрирование различных 3-кето-стероидов. Выращивание культуры N. simplex проводили в ферментере (рабочий объем 8 л) аэробно (рО2 30%) при 30 °С на среде с глюкозой (15 г/л), дрожжевым экстрактом (20 г/л), КН2РО4 (4,4 г/л), Na2HPO4 (8,8 г/л), pH 6,9, которую засевали 5% 24-ч инокулятом, выращенным на среде аналогичного состава. Индукцию 1(2)-дегидрогеназной активности осуществляли добавлением к растущей в ферментере 24-ч культуре 21-ацетата кортизона в виде спиртового раствора (конечные концентрации 0,2 и 0,6 г/л для 21-ацетата кортизона и этанола, соответственно). Выросшие индуцированные клетки собирали центрифугированием при 4000 об./мин 30 минут. Готовили суспензию клеток в буфере pH 6,9 и использовали для приготовления ферментного препарата или хранили при –18 °С в течение 6 месяцев до последующего использования. Суспензию клеток обрабатывали при интенсивном перемешивании ацетоном, отделяли центрифугированием, сушили, при растирании сухих клеток получали порошок ферментного препарата. Биоконверсию 3-кетостероидных субстратов проводили в среде с метилированным циклодекстрином и менадионом. Анализ продуктов биоконверсии проводили методом ТСХ в системе растворителей бензол : ацетон = 3:1, стероиды визуализировали в УФ-свете при 254 нм. Оптимизировали следующие параметры: время и режим обработки клеток ацетоном, температуры, pH, концентрации биомассы и менадиона, концентрации субстрата и другие условия биоконверсии. Некоторые характеристики полученного препарата представлены в табл. 1. Неоспоримыми преимуществами применения комплексного ферментного препарата по сравнению с нативными клетками N. simplex является отсутствие нежелательных реакций восстановления по 17β и 20β-позициям стероидной молекулы, а также деструкции стероидного ядра. Преимуществом препарата в сравнении с очищенными 3-КСД является простота, технологичность и дешевизна получения и расширение субстратного спектра. Таким образом, получен ферментный препарат, обладающий 1(2)-дегидрогеназной активностью в отношении различных 3-кето-стероидов, найдены оптимальные условия его эффективного использования. Результаты имеют высокую практическую значимость для разработки новых технологий производства ценных 1-дегидростероидов.
DOI:10.34756/geos.2022.17.38378