Zobrazit v EDS

Новый способ получения каспазы-3

Uloženo v:
Podrobná bibliografie
Název: Новый способ получения каспазы-3
Zdroj: Школа-конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Генетические технологии в микробиологии и микробное разнообразие».
Informace o vydavateli: Crossref, 2024.
Rok vydání: 2024
Témata: апоптоз, способ получения, продукция, каспаза-3
Popis: Апоптоз – один из видов программируемой клеточной гибели – является ключевым процессом в развитии и жизнедеятельности многоклеточных организмов. Он отвечает за поддержание гомеостаза в эмбрио- и онтогенезе, за нормальное развитие нервной и иммунной систем. Результатом нарушения апоптоза является возникновение различных патологических состояний. Так, неконтролируемый апоптоз приводит к развивитию целого ряда нейродегенеративных заболеваний. Инактивация апоптоза – одна из основных причин развития онкологии и возникновения лекарственной устойчивости раковых клеток. Каспаза-3 – представитель семейства цистеиновых протеаз – центральный участник апоптоза. Она синтезируется в клетках в виде неактивного предшественника, прокаспазы3, после активации которой процесс апоптоза приобретает необратимый характер. Каспаза-3 расщепляет большинство субстратов апоптотического каскада. Кроме того, каспаза-3 играет ключевую роль в активации провоспалительных цитокинов, в процессе дифференциации миоцитов, сперматогенезе и ряде других жизненно важных процессов. В связи с этим активация каспазы-3 в клетках исследуется при разработке и тестировании новых лекарственных препаратов. Наборы для детекции и измерения ее активности применяются в различных молекулярнобиологических, биохимических и медецинских исследованиях. К настоящему моменту предложено несколько способов получения препарата каспазы-3. Они орснованы на продукции активной формы фермента, ренатурации неактивных субъединиц или активации химерной прокаспазы-3 тромбином. Недостатками этих подходов являются токсичность для штамма-продуцента, низкие выход и качество препарата, и, как следствие его дороговизна. Известно, что в клетках млекопитающих активность каспазы-3 ингибируется белком XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein), а именно его доменом Bir2. Мы установили, что при ко-экспрессии прокаспазы-3 и Bir2 домена в клетках E. coli происходит ингибирование автокаталитического процессинга и созревания профермента и наблюдается суперпродукция прокаспазы-3. На основании этого мы разработали новый простой двухстадийный способ получения ферментного препарата каспазы-3. На первой стадии прокаспаза-3, слитая с олигогистидиновой метокой, нарабатывается совместно с доменом Bir2 белка XIAP в бактериальной культуре. Далее белковый комплекс иммобилизуется на металл-хелатном носителе Ni-NTA, и затем разрушается на хроматографической стадии в специальныо подобранных условиях. После элюции с сорбента, в отсутствии белка Bir2, очищенная прокаспаза-3 катализирует собственный процессинг in vitro и переход в активную форму, каспазу-3. Таким образом, нами разработан новый простой, продуктивный, эффективный и дешевый способ получения широко востребованного в биологических и медицинских исследованиях ферментного препарата каспазы-3.
Druh dokumentu: Article
Conference object
Jazyk: Russian
DOI: 10.34756/geos.2023.17.38765
Přístupové číslo: edsair.doi...........ac7050ab61519738d636dc6b5ac6fbcd
Databáze: OpenAIRE
Popis
Abstrakt:Апоптоз – один из видов программируемой клеточной гибели – является ключевым процессом в развитии и жизнедеятельности многоклеточных организмов. Он отвечает за поддержание гомеостаза в эмбрио- и онтогенезе, за нормальное развитие нервной и иммунной систем. Результатом нарушения апоптоза является возникновение различных патологических состояний. Так, неконтролируемый апоптоз приводит к развивитию целого ряда нейродегенеративных заболеваний. Инактивация апоптоза – одна из основных причин развития онкологии и возникновения лекарственной устойчивости раковых клеток. Каспаза-3 – представитель семейства цистеиновых протеаз – центральный участник апоптоза. Она синтезируется в клетках в виде неактивного предшественника, прокаспазы3, после активации которой процесс апоптоза приобретает необратимый характер. Каспаза-3 расщепляет большинство субстратов апоптотического каскада. Кроме того, каспаза-3 играет ключевую роль в активации провоспалительных цитокинов, в процессе дифференциации миоцитов, сперматогенезе и ряде других жизненно важных процессов. В связи с этим активация каспазы-3 в клетках исследуется при разработке и тестировании новых лекарственных препаратов. Наборы для детекции и измерения ее активности применяются в различных молекулярнобиологических, биохимических и медецинских исследованиях. К настоящему моменту предложено несколько способов получения препарата каспазы-3. Они орснованы на продукции активной формы фермента, ренатурации неактивных субъединиц или активации химерной прокаспазы-3 тромбином. Недостатками этих подходов являются токсичность для штамма-продуцента, низкие выход и качество препарата, и, как следствие его дороговизна. Известно, что в клетках млекопитающих активность каспазы-3 ингибируется белком XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein), а именно его доменом Bir2. Мы установили, что при ко-экспрессии прокаспазы-3 и Bir2 домена в клетках E. coli происходит ингибирование автокаталитического процессинга и созревания профермента и наблюдается суперпродукция прокаспазы-3. На основании этого мы разработали новый простой двухстадийный способ получения ферментного препарата каспазы-3. На первой стадии прокаспаза-3, слитая с олигогистидиновой метокой, нарабатывается совместно с доменом Bir2 белка XIAP в бактериальной культуре. Далее белковый комплекс иммобилизуется на металл-хелатном носителе Ni-NTA, и затем разрушается на хроматографической стадии в специальныо подобранных условиях. После элюции с сорбента, в отсутствии белка Bir2, очищенная прокаспаза-3 катализирует собственный процессинг in vitro и переход в активную форму, каспазу-3. Таким образом, нами разработан новый простой, продуктивный, эффективный и дешевый способ получения широко востребованного в биологических и медицинских исследованиях ферментного препарата каспазы-3.
DOI:10.34756/geos.2023.17.38765